生药鉴定常用术语(3)
2有关问题的讨论
A.用单体对照品可确切地鉴别某种成分，科学性强，但当所检成分为数种药材所共有时，则专属性差。其鉴别结果只能证明是否含有此成分，而不一定能确定是否含有某药材。如黄连应检出小檗碱斑点，但检出小菜碱斑点的则不一定就是黄连。很多药材的薄层色谱图斑点很多，其中数个均为已知成分，但并非每一斑点均要用对照品对并指出其上下各为何种成分斑点即可，如德国药典芦荟鉴别即是。
B.采用药材对照品对照.往往能提供更多的鉴别倍息。在单体成分不易得或特征斑点为未知成分时，可以采用。但对于多来源药材，各品种之间的色谱图可能有差异，如中国药典收载的甘草有甘草、光果甘草和胀果甘草三种来源，若选用其中某一种作对照.而成药中所投原料为别种时，薄层层析结果就可能不完全相同。因此在制定质量标准前，应对各品种进行考察，找出共同的特征斑点作为鉴别依据。
反之，由于同属植物往往含有相近似的化学成分，其色谱必然也存共同之处。然而中药的伪品许多为近缘植物、如所定鉴别方法不能区别出伪品，则无意义。在制定质量标准时，最好进行正品与伪品对比，选出两者有明显区别的展开系统，必要时增加伪品的检查项目，加大黄与土大黄均含蒽醌类成分，可增加土大黄苷的检查藉以区别。
药材对照品的选用，应注意品种确切、质优、均均性和稳定性。药材产地、采收期、加工方法不同等引起成分差异，也应进行必要的考察。
药材对照品与化学单体同时应用则效果更佳.药典中收载多种药材的鉴别如人参即是；国外药典如USP鉴别洋地黄，即同时采用了洋地黄粉参比标准品及digitoxin、gitoxin二种单体对照品。
C提取物对照品只能用于鉴别试验而不可用于定量，文字描述而不用实物对照品只适用于色谱斑点少而清晰，特征性强的条件下，否则极难描述清楚；而相对比移值的方法作为研究探索性试验尚可，因层析条件标准化程度差，影响色谱斑点位置因素较多，不可用于法定标准中。(注2005版药典中规定对照品、对照药材、对照提取物、标准品除另有规定外应置五氧化二磷减压干燥12小时以上使用)
(4)薄层色谱应以彩色照片记录其真实性，日光下显色明显的可复印，定量试验也可用扫描图(从原点至前沿)记录。
(六)检查
主要指控制药材或制剂中可能引入的杂质或与药品质量有关的项目。归纳为三类：
1.质量参数类型：与质量直接有关的专定检查项目，如大黄中检土大黄苷；川乌、草乌炮制后乌头碱的限量；黄连素中检棕榈碱及药根碱等；监测伪品的掺人、药物纯度及安全性等。
2.剂型的要求类型，制型不同剂型有不同的质量要求，如固体制剂要求测水分；酊剂、酒剂要求测含醇量，总固体、相对密度、PH值等；片剂、胶囊要求侧重量差异、崩解度，近代已发展要求测均匀度、溶出度，这是重量差异与崩解度的延伸。药典附录根据有关剂型分别要求检查不同项目。
注射剂要求比较严格，在研制过程中对澄明度、pH值、蛋白质、鞣质、重金属、砷盐、草酸盐、钾离子、树脂、炽灼残碴、热原、无菌等项均应做检查，有些如呈阴性或限度极低，在标准正文中可不做规定，但研究资料均应记述于起草说明中。总固体的测定在注射剂中列于含量测定项下，以此量为基础，计算所含有关成分的量。(2005版药典中增加安全性控制指标对测定重金属和有害元素要求更加严格，有一条说明：中药用硫磺熏，以漂白、增艳、防虫虽是传统加工方法，但现代研究证明由此会使中药材残留大量的二氧化硫(SO2)及砷(As)、汞(Hg)等重金属，新版药典删除了山药、葛根等加工方法中的硫磺熏。这表明中药材以后将不再允许用硫磺熏，并且还拟将在2005年版增补本中增加二氧化硫残留量测定法。而我们的新药益通丸中的主要就是葛根，所以我们要引起重视)
3.污染的控制类型
(1)异物污染 可分为钝性异物和有害异物两类，前者如夹杂泥沙杂草、非药用部位等；钝性异物的存在主要是影响剂量的准确及疗效的显现；有害异物的污染则可能造成严重质量事故，如曾发现赤芍中杂有三分三，从而出现中毒事故。在检查项下规定灰分，酸不溶性灰分及异性有机物等。
(2)昆虫及微生物污染 自六十年代以来，国内外对非灭菌药物制剂(包括药材与中成药)的生物性污染都有一些考察，有些属严重污染，据国外报道，在一份甘草中分离出黄曲霉菌的代谢产物黄曲霜毒素B1及B2；有些外用成药中曾检出破伤风杆菌等。染螨与虫霉情况，冲剂、蜜九尤以糖浆染螨与发霉应加强检查，国内中成药卫生学检查已为常规要求。
(3)化学污染 可能来自土壤、化肥、化学除草剂、农药、药材熏蒸、杀虫剂、水源等。材污染有害金属汞、铝、镉、铬等国内也有报道。有时因水质欠佳，洗涤药材后污染铬、砷，用含砷且高的硫磺作熏蒸剂，使贝母、金银花等含砷量高，另据新加坡商反映，新、马二国限度规定为(ppm)：
砷 铜 铅 汞
新加坡 5 150 20 0.5
马来西亚 6 20 10 0.5
香港砷限量为10pPm；铜为50ppm。新药的研制均应作砷与重金属检查，检出量极低的在正文中可不作规定
2005版药典对西洋参、白芍、甘草、丹参、金银花、黄芪等首次规定其含重金属限量为：铅(Pb) ≤5.0mg/kg， 镉(Cd) ≤0.3mg/kg，汞(Hg) ≤0.2mg/kg，砷(As)
≤2.0mg/kg，铜(Cu)
≤20.0mg/Kg。
(七)含量测定
中药材多为天然产物，含有多种成分，中成药及制剂又多为复方，所合成分更为复杂、但常共具临床疗效，有时甚至具双向调节作用、很难确定某化学成分是中医用药的唯一有效成分，有些尚不一定能与中医用药疗效完全吻合，或与临床疗效直观地比较。然而药物的疗效必定有其物质基础，根据中医药理论，结合现代科学研究，择其具生理活性的主要化学成分，作为有效或指标性成分之一，建立含量测定项目，评价药物的内在质量，并衡量其商品质量是否达到要求及产品是否稳定，是完全必要的。
1.含量测定选定原则
(1)项目与药味的选定
1根据目前我国中成药标淮化程度及生产单位设备条件研究建立一项较为完善的含量测定，包括方法准确、灵敏、考核实验数据齐全，累积相当数据，限度制定合理，即认为基本符合要求，但如君药、贵重药、剧毒药同时存在，则要求二项测定也不算过分。对出口中成药，多要求建立二项以上的含量测定；尤其对于注射剂，要求大部分成分或组分均要说清楚，更要研究建立多项测定，以达可控要求，保证药物安全有效。外用药也同样要求研究建立含量测定项，控制质量。
2单方制剂所含成分必须基本清楚、即如明确为生物碱类等，并搞清其中主要成分的分子式与结构式，既能测定其总成分，又便于以主要成分计算。
③复方制剂处方原则有君、臣、佐、使之分，应首先选其君药及所含贵重药建立含量测定项。如具泻火舒肝功能的左金丸，具清热解毒功能的万氏牛黄清心丸中，测定黄连、黄柏中小檗碱是合适的，但这绝不意味着中医用药主要用小檗碱代黄连、黄柏，甚至黄连、黄柏通用，而是以此成分衡量各自的成药质量。含毒剧药的如马钱子、生川乌、草乌、蟾酥、斑瞀等，应重点研究，建立含量测定项；量微者也要规定限度试验。
④对前述药味基础研究薄弱或在测定中干扰成分多.也可依次选定臣药等其他药味进行含量测定，但须在起草说明中阐述理由。
(2)测定成分的选定
①有效成分或指标性成分清楚的可行针对性定量。
2成分类别清楚的，可对总成分如总黄酮、总皂苷、总生物碱等进行测定。但必须无干扰才进行。
3所测成分应归属于某一单一药味；如成药中含有二种以上药味具相同成分或同系物(母核相同)，最好不选此指标，因无法确证某一药材原料的存在及保证所投入的数量和质量。但如处于君药地位，或其它指标难于选择测定，也可测定其总含量，但同时须分别测定药材原料所含该成分的含量，并规定限度。在保证各药味质量的基础上，达到控制成药质量的目的。如黄连与黄柏.枳实与枳壳，川芎与当归等常同时处于同一处方中，并居君药地位，则可测定成药中的小檗碱、橙皮苷、阿魏酸等，并同时分别控制各药材原料有关成分的含量。
4对于因药材原料产地和等级不同而含量差异较大的成分，需注意检测指标的选定和产地的限定。如麻黄主含左旋麻黄碱和右旋伪麻黄碱，由于我国麻黄产地分布极广，从东北至西北的各产地麻黄中，左旋麻黄碱含量递减，而右旋伪麻黄碱含量递增、目前检测技术虽然可以同时分别检测数种生物碱，但在质量评价上仍以测定总碱为宜，只有在制剂中测总碱有干扰时才测定某种生物碱如左旋麻黄碱，但需要限定取材于适宜的产地，否则难于保证质量。
5含量过低的成分较难真正反映成药的内在质量。药材原料(如大黄、何首乌等)所含大类成分如总蒽醌含量较高，但在复方制剂中由于工艺制备过程中的损失.含量已经降低，所以当测定大类成分有干扰，改测定某一单一成分如大黄素时，含量仅为十万分之几。由于样品不均或工艺及检测操作稍有误差则对含量影响极大。
⑥检测成分应尽可能与中医用药的功能主治相近，如山楂在成药中若以消食健胃功能为主，则应测定其有机酸含量；若以活血止痛治疗心血管病为主，则测其所含黄酮类成分，因其具有降压、增强冠脉流量、强心、抗心率不齐等作用。
7中西药结合的制剂一般不提倡，除非经拆方试验，药效学证实复方制剂优于单独中药或西药，此药才能成立。含量测定则要求不仅测中药君药，所含西药也必须建立含量测定项目。
8复方制剂中由于某些药味基础研究工作薄弱，测定干扰难以克服或含量极低，无法进行某些成分含量测定的，也可选择适宜的溶剂进行浸出物测定，如含挥发性成分或脂溶性成分可作醚浸出物测定，前者还可测定挥发性醚浸出物；如含各种苷类成分药味较多，也可测正丁醇浸出物。溶剂的选择应有针对性，能达到控制质量的目的，一般不采用水或乙醇，因其溶出物量太大，某些原料或工艺的影响难于反映质量的差异。
9对成药进行各种探讨均无法确定含量测定项目时.也可择其君药之一的药材原料进行含量测定，间接控制成药质量。
2.含量测定方法
含量测定方法很多，常用的如经典分析方法(容量法、重量法)、比色法、分光光度法、计算分光光度法如二波长、三波长紫外分光光度法、导数光谱法等(因其”杂质”并非恒定，所以计算公式只适用于同批样品，有时不具重观性，故只适合于内控应用)、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层扫描法、薄层一分光光度法或比色法以及生物测定法等等。
含量测定是质量标准的核心部分，它是质量控制中最能有效考察产品内在质量的项目，也是药品稳定性考察最重要的依据。因此，含量测定方法的建立也是质量标准中的难点与重点。在此.以益安宁标准的研究作介绍。
(1)实验设计：
仪器分析方法为因素A
前处理方法为因素B
(2)供试品溶液的制备
(3)色谱条件及测定法
3.方法学考察
新药可以引用药典或文献收载的与其相同成分的测定方法，但因品种不同，与自行建立新方法一样.均要进行方法学考察研究。一般考察项目如下：
(1)提取条件的选定 优选提取条件对测定结果有直接影响、持别对于制剂中含有药材原粉的，即由组织细胞中提出有关成分，提取方法的选择尤为关键，常见的提取方法有冷浸、热浸回流、索氏提取器提取、超声波提取等，滤除残渣即得提取液。对提取液的取舍一般有两种方法，一种为取全量，即充分洗净残渣，并将洗涤液合并于提取液中；另一种为取一定量，即在提取前精密加入定量溶剂，称重，提取后.再补充提取过程损失的溶剂，摇匀，过滤，精密吸取-定量的提取液.进行含量测定，最后结果按相当的样品量计算，即得。
提取条件的确定，一般要有不同溶剂、不同提取方式、不同时间以及不同温度、PH值等条件比较而定，可参考文献，重点对比某种条件.也可用正交试验全面优选条件，再配合回收率试验或与经典方法比较，从而估计方法的可靠性c
(2)分离纯化 根据被测成分的性质，采用一定方法，排除干扰物质，使供试样品达到-定纯净度。特别是气相、液相色谱分析更应注意此点，以提高分析准确性并可保护色谱柱。
(3)测定条件的选择 如比色法、高效液相、薄层扫描法中最大吸收波长的选择，液相色谱法中固定相、流动相、内标物的选择，薄层扫描法层析与扫描条件的选择等。
(4)空白试验 在色谱法中常用阴阳对照法，即以被测成分或药材与除去该成分或该药材的成药作对照，可考察被测成分的斑点(或峰)位置是否与干扰组分重迭，以确证测定指标(如吸收度、蜂面积)是否仅为被测成分的响应，防止假阳性的误判。紫外分光光度法或比色法中的空白对照液常见的有溶剂空白、试剂空白(溶剂加显色剂)，对复方制剂也须同色谱法做阴性对照.确证吸收度仅为被测成分的响应。对单一成分或大类成分测定，均须做此试验。
(5)样品浓度与响应值样品浓度与吸收度或色谱峰面积(或峰高)之间的线性关系考察、即标准曲线的制备。
紫外分光光度法或比色法须制备标准曲线，用以确定取样量并计算含量。色谱法一般均采用对照品比较法如外标法或内标法测定，但也必须进行线性考察，目的有三：a.确定样品浓度与峰面积或峰高是否呈线性关系；b.确定线性范围，即适用的样品点样或进样量的确定；c.直线是否通过原点，以确定是以一种或二种对照品量(即一点法或二点法)测定并计算。标准曲线相关系数应在0.999以上，薄层扫描法可在0.995以上。
(6)测定方法的稳定性实验 此项考察目的是选定最佳的测定时间范围。用紫外分光光度法、比色法或薄层扫描法等测定时，应对被测液或薄层色谱斑点的吸收度值稳定性进行考察，即每隔一定时间测定一次，延续3-4小时，视其是否稳定，以确定适当的测定时间。
(7)精密度试验 如气相、液相色谱法对同一供试液多次进样测定，簿层扫描法对同一薄层板及异板多个同量斑点扫描测定，可考察其精密度，对同一薄层斑点连续进行多次测定，则可考察仪器精密度。
(8)重复性试验 按拟定的含量测定方法，对同一批样品进行多次测定(平行试验至少5次以上，即n>5)，计算相对标准偏差(RSD)，一般要求低于5%。同一人测定多次称重复性，不同人或实验室测定称再现性。
(9)检测灵敏度及检测下限的测定， 分析方法的灵敏度-般以工作曲线的斜率表示。其值越大.方法的灵敏度就越高。色谱法的灵敏度可以用峰高(mm)/对照品量(mg)表示。最小检出量即检测下限，一般按经验法设计数个不同进样量，以目测估计最小俭出量。有时常把最小检出量理解为灵敏度，实际上两者概念不同。
(10)回收率试验 含测方法的建立，多以回收率估计分析的误差和操作过程的损失，以评价方法的可靠性。回收率实验设计也有多种，在中成药分析中常见的有以下几种；
①加样回收，即于已知被测成分含量的成药中再精密加入一定量的被测成分纯品，依法测定。用实测值与原样品中含测成分之差，除以加入纯品量计算回收率。此法不用制备空白对照，模拟真实性好。对单味药材的回收率测定，因不易制备除去被测成分的药材空白对照品，只能用加样回收法，如用提净被测成分的药渣作空白，则意义不大，因为在除去被测成分的同时，干扰成分也被除去了。
在加样回收实验中首先须注意纯品的加人量与取样量中被测成分之和必须在标淮曲线线性关系范围之内；外加纯品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。一般加入量与所取样品含量之比控制在1：1左右。
对于加样回收的计算方法，也有用实测值除以理论总量(样品中所含被测成分量与加入纯品旦之和)计算的，但仍以前述计算方法为公认。
2以成药空白(即除去欲测药材后制成的成药)，精密加入被测化学成分纯品，依法测定。以加入纯品量为理论值，由实测值计算回收率。此法理论值较准确，但其不足是缺少成药中被测药材本身的杂质干扰条件，模拟真实性差，特别是被测药材组分复杂，如人参被测成分为人参皂苷Re、因与该成分共存的同系物或类同成分人参皂苷较多，其自身分离度重现性差，而只以加入纯品测定回收率，与人参皂苷Re的干扰情况则无从反映。故此种回收率测定只能用于被测药材成分较为单一者。
3取成药空白，精密加人已知被测成分含量的药材，依法测定。以加入药材所相当的被测成分量为理论值，再由实测值除以理论值计算回收率。此法模拟真实性好，能反映被测药材中其它成分的干扰情况，但由于已知含量药材也是同法测得的平均值，故其理论值实际包括正负误差在内，有时也能掩盖系统误差。特别是单味原料(药材)制剂，仍以采用加样回收法为宜。回收率试验至少需进行5次试验(n＝5)，或三组平行试验(n＝6)，在同一批样品中加入相同或不同纯品量，后者可进一步验证测定方法中取样量多少更为合适。
回收率一般要求在95～105%，一些方法操作步骤繁复，可要求略低至少不小于90%。
4.含量测定方法实验设计中应注意的几个问题
(1)提取问题 对含药材原粉的制剂，如采用取部分提取液的测定方法，不宜将样品粉末直接置容量瓶中定容，因为中药含量测定的取样量往往较大，且药粉不溶于水，其固体体积不可忽视。例如将0.5g九分散于10m1容量瓶中，以刻度吸管加入溶剂约7mL即已至量瓶刻度。可将样品称人具塞锥形瓶中，精密加入溶剂10m1计算全量。
(2)测定大类成分如总黄酮、总皂苷等问题
①如所测总成分以某一单体成分为对照品制定标推曲线并计算，应首先考虑对照品溶液与供试品溶液最大吸收波长是否一致，有的相差很大或供试品溶液根本无最大吸收，方法则不能成立。
2阴性(空白)对照液即除去欲测成分的药材原料制备的样品液，依法测定其吸收图谱，与基线吻合，或略有吸收，在无其它方法可循的情况下，其吸收值若低至样品吸收值5%以下可忽略不计。因考察中药多为天然药物，含量幅度较大，又为大复方，不可认为无吸收峰即视为无干扰。
3按上述方法制备背景空白以消除干扰是不可行的。例如样品吸收值为0.6，而阴性对照液吸收值为0.2，即以0.6一0.2＝0.4计算样品含量。由于处方原料不相同，工艺未知，配制出的背景空白不可能条件相同，吸收值差异较大，故此方法无推广价值。只有在原料来源不变，工艺稳定的情况下作为企业内部的质控方法暂时使用。
④为了消除其它组分干扰，采用导数光谱或二波长，三波长等方法测定单一或大类成分，仅可用于药味较少的制剂，其空白试验取多批次样品测定，结果一致才可采用。因中药复方与西药不同，后者所谓干扰组分均为结构已知具有一定规格的成分，而中药则大部为未知成分且不衡定，有些测定只有一次性的意义，不具重现性。
(3)回收率测定问题 在一些实验设计中，常见到所谓的加样回收测定，不是在称样开始时即加入纯品，而是将其加至制备好的供试品溶液中，这样不能考察提取、纯化过程中被测成分是否损失；也有在薄层扫描试验中，于薄层板上依次点对照品溶液、供试品溶液及对照品与供试品重叠点于同一原点上，测定后计算，这只能反映板上的回收率，而不能代表全部含量测定方法的回收率。
(4)对照品问题 含量测定用对照品只能用化学纯品，不可用药材对照品，因为不可能得到所含成分含量同一的样品。
测定大类成分如皂苷也不宜采用总皂苷为对照品，因总皂苷组分复杂，各成分比例不稳定，不同批次的皂苷难于保持一致，从而使含量测定结果不稳定。测定总皂苷时，采用同系物之一的化学单体并以其计算，定出限度是可行的。如测定人参总皂苷，以人参皂苷Rbl、Re等作对照品并计算。但如处方中含有的不同药味皂苷成分结构差异较大，有的甚至不是皂苷而是其它各种苷类，例如处方中有黄芪、人参、地黄、知母、赤芍等，而以黄芪甲苷或人参皂苷Re为对照品测定并计算含量，科学根据不足，不能成立。
5.含量限度的制定 含量限度是在检验方法确定的基础上，积累足够的数据后总结提出的。成药的合格是建立在药材原料的质量保证上的。日本对栽培药材常收集上百件样品进行测定，对结果做分布分析，有的下限取在去除约5%样品的数值上，即将占总量5%的质量最差、分布极小的样品判为不合格。我国则根据宝贵的传统鉴别经验，将药材样品依质量优劣顺序排列，如所测成分含量高低与之相应，则将质次但仍可药用者取为下限。必须强调的是，含量限度的制定应有足够的、具代表性的样品数据为基础。否则就不能反映实际情况，实践中势必会遇到种种问题。新药申报生产时应积累10批以上的含量数据，提出限度。
中药制剂含量限度规定的方式，根据现行各级标准有以下几种。一种是规定下限，如药典中收裁戊己九，对所测成分如黄连中总生物碱以盐酸小劈碱计不得少于3.0%，六味地黄丸，山茱萸中熊果酸、丹皮中丹皮酚分别为不得少于0.020%、0.070%(大蜜九)；-种是规定幅度，如部颂标推进口西洋参药材含人参总皂为5～10%，含西洋参制剂则应根据处方量及工艺制相关数值规定制剂含量幅度；另一种为规定标示量，如2005版药典中收载华山参片，规格为0.12mg/片，规定含生物碱以其莨菪碱计应为标示量的80.0～120.0%。
应该强调指出中成药与某些制剂不同，如甘草流浸膏类可根据甘草酸的含量调节甘草浸膏的投料量，而中药则必须保证处方不变，成品率稳定。因此只有投入合格的原料才能保证成药的质量。
关于中成药的含量表示方法，有%、mg/片、”g/丸、mg/m1(液体制剂)等。凡药品中规定有含量测定项的，其原料药材必须对成品中所测成分规定含量限度，防止盲目投料，可限定为本制剂专用的原料药材规格，暂不要求代表全国各地药材的质量，达不到要求者可以不进货，不投料，以保证产品质量。
六、质量标准起草说明
起草说明是质量标淮制定的详尽的技术资料。对质量标准中各项均应作逐项说明。名称、处方、制法、功能主治、用法用量等，在申报资料中各有要求，故在起草说明中可以简要概述，但不可从略。而有关检定该药真伪优劣各项均应重点详细说明。
对鉴别、含量测定药味各测定成分的选择依据，方法原理，实验条件的选择和方法学考察资料和数据，空白试验说明杂质干扰及排除情况，附有关图谱如最大吸收波长选择图、标准曲线图，色谱图包括空白试验图，薄层色谱附彩色照片，显示色谱的真实性。
阐明确定检查及含量限(幅)度的意义和依据。新药申报生产或标准试行期满转为部颁标准前至少应有10批以上产品的测定数据。
值得强调的是，应阐明其它曾经做过的试验，包括不成熟的尚待完善或失败、暂末收载或不能收载于正文的检定方法的理由，并提供详尽的实验资料，以便有关部门审查其实验设计是否合理，以确定为主观原因或客观原因，从而判定是否需要作进一步实验的依据。
起草说明的书写格式应按质量标准项目依次予以说明，其与研究报告不同，不能以综述性讨论代替。
Recent Comments